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本制品是一种采用环保脱蜡方式去除石蜡后磁珠法提取切片中总RNA的试剂盒，获得的RNA包含大分子量RNA和小RNA (<200nt)，也常被称为总RNA，可用于反转录、qRT-PCR或转录组测序等下游实验。本试剂盒也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA提取。

本试剂盒的标准操作步骤提取得到的总RNA含有少量DNA，但如果按照可选步骤加入DNase，就可以获得不含DNA的高纯度总RNA。

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)常应用于癌症等疾病研究中保存离体组织的形态学和组织学结构，以便于运输和储存，是病理样品长期保存的主要方法之一。组织样品经福尔马林固定时，组织内细胞中的核酸和蛋白质等分子间随机交联，核酸出现片段化，因此难以获得高质量核酸。本试剂盒采用环保脱蜡法去除石蜡，以特殊的裂解条件释放FFPE组织样本中的RNA分子，最大程度地降低了福尔马林固定时组织内细胞中RNA与其它分子交联的不利影响，经本试剂盒提取获得的RNA纯度高、完整性好、质量稳定。

• 本试剂盒提取获得的石蜡包埋组织样品总RNA纯度高。提取获得的RNA A260/A280的范围通常在1.7～1.9之间。
  
• 本试剂盒使用安全、高效。本试剂盒通过特殊的磁珠进行RNA分离纯化，能有效避免常规方法提取RNA时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。
  
• 本试剂盒操作快速、便捷。本试剂盒采用磁珠纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，纯化RNA操作过程仅需约15～20分钟即可完成。和国外同类磁珠纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。百奥莱博同时提供石蜡包埋组织RNA提取试剂盒，而磁珠法提取得到的RNA包含<200nt的小RNA或部分降解、断裂RNA，提取更完全。

• BalbMag RNA磁珠长期不使用时，可以4℃保存，4℃可以保存更长时间。蛋白酶K室温(15～25℃)存放一周，活力无明显下降。
  
• 本试剂盒的标准操作步骤提取得到的总RNA含有少量DNA，但如果按照可选步骤加入DNase，就可以获得不含DNA的高纯度总RNA。
  
• 如果希望获得更高质量的RNA，宜尽量使用新鲜固定和包埋的组织样品。拿到组织样品后尽快在4～10%福尔马林中固定，固定时间最好在8～24小时之间或更短时间，长时间固定会使RNA断裂更为严重。
  
• 样品包埋前应确保彻底脱水，残留的甲醛可能抑制蛋白酶K的消化等相关实验步骤。
  
• 本试剂盒提取RNA依赖于样品类型、储存时间以及固定条件。样品固定时间和保存时间过长(＞1年)易破坏RNA完整性，无法提取出长片段。
  
• 石蜡包埋组织提取得到的RNA，由于样品的特殊性，存在可能的断裂或降解，通常不建议用于需要全长RNA的下游应用。
  
• 温度较低时裂解液或结合液中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍，如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
  
• 第一次使用前小包装洗涤液I需添加34mL无水乙醇，洗涤液II需添加39mL无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
  
• 本试剂盒须将FFPE样品56℃和80℃孵育。
  
• 使用本试剂盒须提前备好无水乙醇和异丙醇。
  
• 除特别说明外，每次Vortex应控制在5～10秒左右。
  
• 如果不使用试剂盒提供的DNase进行处理，本试剂盒提取得到的RNA会含有少量DNA。后续如进行某些对DNA残留敏感的实验时，需要在使用说明步骤3b后，在磁珠中加入适量DNase进行消化，具体请参考使用说明。如果基因组DNA消化不充分，可以加大DNase的用量或延长孵育时间。DNase用量如果需要加大，可以考虑订购百奥莱博的RNase-free的DNase I。
  
• 本试剂盒需自备磁分离装置。
  
• 磁珠在静置后会发生沉降，使用前一定要适当涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。
  
• 磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。
  
• 请使用推荐的样品量。如果样品量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响提取获得的RNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少样品用量。
  
• 本试剂盒提供的所有试剂都是RNase-free，操作时应小心，避免被RNase污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩。
  
• 对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
  
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。

本试剂盒提取RNA的实验流程如图1所示。首先使用环保的脱蜡剂和蛋白酶K将FFPE样品脱蜡、消化，释放出来的RNA在特定条件下与磁珠特异性结合。在外界磁场(如磁分离架)的作用下，磁珠与相应溶液可以快速高效地分离。随后通过四次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把RNA洗脱下来。

• 得到的RNA经DNase I处理。实际结果会因样品、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 样品处理：
  
  • 石蜡包埋组织切片：取2～8张的石蜡切片(5～10μm厚，表面积小于1×1cm2)。
    
    • 如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。
  • 福尔马林固定组织：取10～25mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5mL离心管中，加入500μL的PBS(pH7.4，无酶无菌)，Vortex震荡混匀，12000×g离心1分钟后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2h开始操作。
• 脱蜡和裂解：
  
  • 将石蜡切片置于1.5mL离心管中，加入600μL的脱蜡剂，剧烈Vortex 30秒，以充分脱蜡。
    
    • 福尔马林固定液中的组织样品无需加脱蜡剂，直接转入步骤2h开始操作；如果石蜡样品过多，可以将脱蜡剂用量增加至1mL。
  • 室温，≥14000×g离心5分钟。
    
  • 使用吸头小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。
    
  • 加入1mL无水乙醇，Vortex混匀。
    
  • 室温，≥14000×g离心5分钟。
    
  • 使用吸头小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。
    
    • 可以用新的10μL吸头小心吸去残留的乙醇，有利于乙醇挥发。
  • 打开管盖，室温放置5～10分钟直至残留的乙醇完全挥发。
    
    • 残留的乙醇会对RNA产生影响，可以将离心管置于37℃环境下挥发乙醇。
  • 加入150μL裂解液和10μL蛋白酶K，Vortex混匀，56℃金属浴或水浴孵育15分钟或直至样品完全裂解。
    
  • 将完全裂解的组织样本置于80℃孵育15分钟，之后短暂离心使管盖上的蒸发液体回到管中。
    
    • 80℃孵育对修复RNA变形解交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的RNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至80℃再放入样本进行孵育。
  • 室温，14000×g离心5分钟，转移上清液(150μL)至新的离心管中，注意不要碰到沉淀。
    
  • 向上述新的离心管中加入200μL结合液，Vortex混匀；再加入300μL异丙醇，Vortex混匀。
    
    • 加入结合液和异丙醇后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀彻底混匀，但不会干扰后续实验。
• 纯化RNA：
  
  • 向步骤2k中的混合物加入20μL BalbMag RNA磁珠悬液(使用前务必混匀)，轻柔混匀后，室温放置3～5分钟。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。
    
    • 磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。
  • 加入500μL洗涤液I，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
    
  • 选做：如果略去本步骤，通过本试剂盒提取得到的RNA会含有少量基因组DNA。后续如进行某些对基因组DNA残留较敏感的实验时，可在上一步骤洗涤后，在磁珠中加入80μL含2μL DNase的酶溶液(每80μL酶溶液按照70μL水加8μL 10×Reaction Buffer再加2μL DNase混合配制而成)，37℃震荡消化15分钟。消化结束后，不需要任何额外操作，直接进入步骤3d。
    
  • 加入500μL洗涤液I，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
    
  • 加入600μL洗涤液II，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
    
  • 重复步骤3e一次。
    
  • 将离心管室温放置5～10分钟，或置于37℃烘箱5分钟，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
    
  • 加入50～100μL洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3～5分钟，其间甩动离心管1～2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20℃保存。所得溶液即为纯化的总RNA。
    
    • 如果有必要，可以使用超纯水洗脱RNA，洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，使用超纯水洗脱时应保证其pH值在7.0～8.5之间。推荐无菌无酶超纯水。
    • 如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μL，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次，可提高得率约10～30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15～40%的RNA。